Прежде чем выйти на рынок или быть испытанным на человеке, любое вещество, будь то лекарственный препарат или косметическое средство, должно пройти тестирование на животных. В связи со вступлением в силу в странах Европейского Союза новых законов, запрещающих такие тесты, возникает вопрос: кто или что может адекватно их заменить, например, в доклинических исследованиях.
Наиболее перспективными здесь уже общепризнанны биочиповые технологии , которые можно объединить под названием «лаборатория-на-чипе» или «человек-на-чипе». Речь идёт об устройствах - микробиореакторах, в которых функционируют миниатюрные клеточные модели различных органов и тканей человеческого тела. Они взаимосвязаны друг с другом через сеть микроканалов - аналогов кровеносных сосудов. То есть, испытывая токсичность того или иного вещества на уменьшенной модели, можно получить информацию о его влиянии на реальный человеческий организм.
Такой подход к решению проблемы доклинических исследований не только может поднять уровень эффективности и прогнозирования для человека, - у него есть шансы существенно снизить риски побочных эффектов.
Разработкой технологии «человек на чипе» занимаются научно-исследовательские группы в Европе, США и России. Молодая российская компания Научно-технический центр «БиоКлиникум», входящая в европейский консорциум AXLR8, уже добилась успехов в области биочиповых разработок. Корреспондент Pro Science встретился с генеральным директором НТЦ «БиоКлиникум», выпускником химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, кандидатом биологических наук Дмитрием Сахаровым.
Расскажите о том, как появилась идея создания технологии «человек-на-чипе» в мире и у вас.
Дмитрий Сахаров: Основа микробиореактора - это живые эукариотические клетки, на которых тестируют действие веществ. Со статическими клеточными монокультурами (один тип клеток) работают уже давно. Прежде всего - это раковые клетки. Примерно 10 лет назад начало параллельно развиваться сокультивирование нескольких линий и 3D-культуры. Сейчас исследователи стремятся найти клеточные линии, которые максимально приблизятся к нормальной клетке по функциональной активности.
Например, раньше активно работали с линией гепатоцитов HepG2 и она показывала 30% от активности реального гепатоцита (клетки печени). Сейчас уже разработана линия HepaRG, которая демонстрирует 70%. В разных научных сообществах обсуждается, насколько эти клетки могут быть названы аналогами реальных гепатоцитов, и всё чаще учёные сходятся во мнении, что по набору метаболических процессов это вполне адекватное подобие натуральной печени.
Сейчас по всему миру исследователи работают над созданием клеточных моделей и других органов и тканей (в организме человека их около 220): для кожи, кишечника, эндотелия сосудов, мозга, лёгкого и прочего. С появлением всё большего числа таких моделей появилась идея их объединения в одной системе, в одном миниатюрном организме. Например, чтобы препарат мог быть введен в циркуляцию через клетки кишечника, затем попал в клетки печени, где прошел его метаболизм, и продукты метаболизма уже попадали в органы-мишени. Лет 5 назад начали появляться первые публикации о технологиях под общим названием «человек-на-чипе». Сейчас в мире существует несколько групп, которые создают микромодели разных органов и их комбинаций.
Именно к таким устройствам и относится наш вариант технологии «человек-на-чипе» - «Гомункулус». Изначально этот проект зародился в Техническом университете Берлина в Германии (Technische Universität Berlin), и примерно 5 лет назад мы подключились к нему, с одной стороны, со своими инженерными разработками, с другой стороны - с клеточными. На первом этапе произошёл трансфер технологий, когда немецкие коллеги передали нам все имевшиеся на тот момент у них разработки и патенты, далее проект начал двигаться параллельно.
Работа ведётся на паритетных началах со всеми необходимыми договорами. Что касается технического оснащения: теперь наши немецкие коллеги заказывают приборы у нас, а не в Дрездене, как это было ранее. Сейчас у них стоит 8 наших машин. За короткий промежуток времени, около полутора лет, в сотрудничестве нам удалось создать уникальный прибор с высокими техническими характеристиками. Сейчас мы занимаемся получением сертификата для того, чтобы его можно было использовать в России как прибор медицинского назначения, также происходит патентование некоторых отдельных его узлов и технологий.
В России мы в данном направлении пионеры, а в Европе «человеком-на-чипе» занимаются четыре группы. И, как показали последние конференции, прошедшие в Берлине (AXLR8-3) и Линце (EUSAAT 2012), мы не только не уступаем нашим западным коллегам, но и опережаем их в технической части после выхода прибора последнего поколения. Это стало возможным в первую очередь благодаря сочетанию в одном коллективе молодых талантливых математиков, физиков, химиков и инженеров.
Путь от идеи в голове нескольких учёных до автономной спин-офф компании - оказался сложным-
Дмитрий Сахаров: У нас под научным руководством члена-корреспондента РАН д.б.н. Александра Григорьевича Тоневицкого возникла амбициозная идея - пойти по европейской модели развития науки. Это когда фундаментальные разработки крупных институтов передаются спин-офф компании, которая их коммерциализирует, осуществляет дополнительные самостоятельные разработки и внедряет на рынок новый продукт или технологию. В российских реалиях такая схема пока редко возникает, поэтому у нас было желание попробовать, и в конце 2008 года была основана фирма БиоКлиникум.
До 2010 года она существовала в зачаточном состоянии - не было ни больших грантов, ни крупных проектов. Осознание перспектив развития БиоКлиникум и бурный рост пришлись на 2011 год, тогда мы начали собирать в штат биологов, химиков, биофизиков и математиков из ведущих российских вузов. К началу 2012 года мы выиграли довольно крупный грант на опытно-конструкторские разработки от министерства образования и науки, и только тогда смогли собраться в одном месте из разных московских институтов.
Сейчас у нас сформировалась частная автономная лаборатория полного цикла: фундаментальные научно-исследовательские разработки, опытно-конструкторские разработки, производство и внедрение. На данный момент у нас в штате около 35 человек. Это и учёные, и инженеры, и административный персонал - все в одном месте под одной крышей. Научным руководителем БиоКлиникум является член-корр РАН А.Г. Тоневицкий. Разумеется, мы работаем не в вакууме, у нас есть ряд партнёров - как в России, так и в Европе.
В каких направлениях ведётся работа в БиоКлиникум в настоящее время-
Д.С.: Сейчас основные направления задаются двумя большими грантами Минобрнауки в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы». Это микробиореактор «Гомункулус» (Homunculus), а также тест-системы в онкологии.
Микробиореактор позволяет осуществлять длительное сокультивирование клеточных культур (моделей органов и тканей). При этом - с тонким мониторингом их состояния, которое дает возможность проводить тестирование веществ различного назначения для выявления их возможного действия на организм человека. А тест-системы в онкологии - это анализ транскриптома удаленной опухоли, построение путей и сетей взаимодействий генов, поиск генов-кандидатов, ответственных за молекулярно-генетические особенности опухоли, влияющие на выживаемость пациента после операции. Оба проекта прорывные, и в этом наша сила.
В глобальной перспективе мы будем сводить их в один, посвящённый персонализированному подходу в лечении онкологических заболеваний. Мы планируем на основе биопсии опухоли пациента и дальнейшем культивировании выделенных раковых клеток в микробиореакторе помогать в подборе индивидуального лечения, так называемая концепция ex vivo подбора терапии.
Для «Гомункулуса» параллельной задачей будет оставаться скрининг новых фармацевтических препаратов, поиск лекарств-кандидатов, оценка их безопасности и эффективности на клеточных моделях органов и тканей человека.
Клеточные модели каких органов вы используете в «Гомункулусе»-
Д.С.: Мы сосредоточились на кишечнике, печени, коже и мозге. В разработке находится эндотелий сосудов. Для более широкого спектра у нас, к сожалению, пока не хватает людских ресурсов, поскольку каждая клеточная модель - это серьёзная научная задача и трудоёмкий процесс. Последний вариант нашего чипа позволяет культивировать 6 клеточных моделей. Здесь точно будет печень, кишечник, мозг, кожа, возможно, появится ещё почка, поскольку это очень важный функциональный орган для выведения продуктов жизнедеятельности организма. Понятно, что невозможно ввести в строй сразу 220 моделей органов и тканей, поскольку в такой системе просто невозможно будет что-либо понять.
При создании своего чипа мы по сути уменьшили организм человека в 100 000 раз. То есть у нас количество клеток меньше в 100 000 раз, количество жидкости меньше в 100 000 раз, пропорционально снижена скорость циркуляции жидкости, то есть мы стараемся с биологической точки зрения остаться в рамках нормальной физиологии. Даже наш насос на чипе сконструирован таким образом, чтобы создавать небольшое сжатие-растяжение клеток, как это происходит при пульсировании крови от сердечных сокращений.
Чем ваш прибор принципиально отличается от немецкого аналога- Чем он лучше-
Д.С.: Каждый наш прибор удовлетворяет всем требованиям к ультрасовременному научно-исследовательскому оборудованию. Он рассчитан на 4 чипа (параллельные эксперименты), оснащён большим графическим дисплеем (удобство управления), есть система термостатирования чипа и подачи СО2 (поддержание заданных условий эксперимента), а также датчики контроля за жизнью клеток. Прибор последнего поколения оснащён большим количеством всевозможных современных «фишечек». Например, это оповещение по SMS и E-mail о неполадках, подключение и управление через Интернет. То есть, если проводится длительный эксперимент, исследователю не обязательно круглые сутки находиться в лаборатории - он может отчасти следить за работой и с удаленного компьютера.
Чего удалось достичь помимо прогрессивной конструкции прибора- Есть ли какие-то серьёзные научные результаты на данный момент-
Д.С.: Сейчас в профильном журнале Lab on chip готовятся к выходу 3 наших публикации на тему «Гомункулуса» - это обзор, описание технологии и описание эксперимента, который мы провели. Можно сказать, что в основном работа по самому прибору завершена, возможны только некоторые небольшие доработки. Сейчас мы сосредоточились на применении «Гомункулуса» при тестировании различных лекарственных препаратов, чтобы понять его возможности. И, пожалуй, одним из самых важных здесь вопросов является валидность нашего микробиореактора. Другими словами, необходимо понять, насколько он способен «быть человеком» и отражать живой организм.
Для этого было решено посмотреть, как откликнутся наши клеточные модели на определённый препарат, действие которого на организм животного и человека хорошо изучено. С этой целью было выбрано противодиабетическое средство - троглитазон, которое вышло на рынок в 1997 году и в 2002 снято, поскольку обнаружилась его токсичность для печени. Тогда было выявлено 600 случаев развития цирроза и множество случаев менее тяжёлых последствий, которые не вскрылись при доклинических испытаниях.
Мы проверили его на чипе, содержащем клетки печени и эндотелия сосудов, в качестве нейтральной ткани была кожа. В ходе эксперимента мы увидели процесс разрушения клеток печени и ряд более глубоких процессов - при том, что остальные две ткани не страдали. Результат был ожидаем, и «Гомункулус» в полной мере себя оправдал.
Этот пример наглядно иллюстрирует, что анализ того или иного препарата на животных не всегда гарантирует безопасность для человека. Разумеется, мы не претендуем на истину в последней инстанции, и микробиореатор стоит рассматривать всё-таки как дополнение к исследованиям на животных.
К сожалению, случай с троглитазоном не единственный. Известен печальный опыт клинического тестирования иммуномодулятора TGN 1412. Доклинические испытания на животных показали прекрасные результаты. Препарат долгое время тестировали на мышах, крысах, кроликах, собаках и обезьянах. Однако во время первой стадии клинических испытаний на 10 абсолютно здоровых добровольцах спустя несколько часов после приёма препарата у всех них развилась мультиорганная недостаточность, закончившаяся для двоих инвалидностью. Препарат вызвал прямо противоположную реакцию организма человека - бешеный иммунный ответ. Стоит отметить, что добровольцам ввели всего одну пятисотую дозы, опробованной на животных. Оказалось, что всё дело в особом типе клеточных рецепторов, которые присутствуют у человека и отсутствовали у подопытных животных. Данный пример подтверждает необходимость создания комплексных in vitro методик тестирования безопасности препаратов с использованием моделей органов и тканей человека. Известно, что новые лекарственные средства, так называемые дизайнерские лекарства (designer drug) обладают высокой специфичностью к человеческому организму, и оценивать их эффективность и безопасность на животных моделях не всегда возможно.
Не менее важной задачей для «Гомункулуса» также является поиск новых лекарственных препаратов перед началом доклинических исследований, когда из 10 тысяч кандидатных веществ 1000 проходит в доклинические исследования, 10 - в клинические, и 1 вещество выходит на рынок. Микробиореактор максимально увеличит эффективность этого отбора и поможет не пропустить в доклинические испытания откровенно ненужные препараты, и одновременно не отмести вещества, которые окажутся полезными при клинических испытаниях. Такой подход позволит существенно сократить затраты при поиске новых лекарственных средств.
Способен ли микробиореактор полностью вытеснить подопытных животных, или что-то остаётся исключительно за «мышами»-
Д.С.: Я бы не был столь категоричен. Всё-таки микробиореактор - это скорее дополнение, может быть, именно для доклинического тестирования. Например, по европейским требованиям для испытания безопасности одного вещества необходимо около 10 000 животных. «Гомункулус» и другие микробиотехнологии - это значительная экономия, в том числе и в длительной перспективе. Большой эффект будет на стадии отбора лекарств-кандидатов.
Кроме того, от научно-исследовательской разработки препарата до выхода на рынок проходит около 25 лет. Здесь огромный ярус занимают доклинические и клинические исследования. Даже если удастся сократить этот период хотя бы на 2-3 года - это уже большое достижение и снижение затрат.
Две недели назад в Европе вступила в силу очередная стадия запрета на тестирование косметических средств на животных. Расскажите, пожалуйста, как Евросоюз переходит на новые технологии в доклинических исследованиях- И как обстоят дела в России и США-
Д.С.: Да, в Европе пришли к пониманию, что помимо неэтичности таких испытаний, результаты этих экспериментов не всегда в полной мере можно перенести на организм человека, особенно, что касается лекарственных препаратов.
В 2009 году в Евросоюзе вышла директива о запрете тестирования острой токсичности на животных, и был дан трёх-четырёхлетний период для перехода на новые клеточные модели, в том числе и микробиотехнологии. Было объявлено большое количество грантов на поиск этих моделей. Сейчас запрет касается не только тестирований на животных в пределах Евросоюза, но запрещено также использовать компоненты, протестированные на животных за границей Евросоюза, скажем в Индии.
Сейчас запрет вступил в силу и касается только косметики. Разумеется, закон обратной силы не имеет, и всё, что вышло до марта 2013 года, на рынке останется, но новые косметические средства смогут попасть в продажу только без участия в их испытаниях животных. Например, на вооружении некоторых европейских компаний уже есть некоторые микромодели - это модель кожи, глаза.
Что касается фармацевтического рынка, то тут тоже идёт движение к созданию in vitro моделей, но они пока не легализованы и не обладают необходимой документацией для массового использования. Каждая компания использует какие-то свои наработки, коммерчески доступные in vitro тесты на клетках, на 3D-культурах и даже сокультивирование клеток. Но в официальной разрешающей документации они идут как дополнительные. Здесь введение запрета продвигается значительно медленнее, поскольку и рынок существенно больше, и он слишком консервативен, да и риск для потребителя значительно выше. Кроме того, на вооружении индустрии пока не существует адекватных технологий замены тестирования на животных. Если кожу вырастить в искусственных условиях довольно легко, то работа с другими органами и тканями пока находится на стадии разработки.
Отдельно стоит сказать об Америке. В США ничего не запрещено, там всё тестируется на животных. На последней встрече Европейского научного сообщества (AXLR8-3 Берлин) по переходу на использование новых тест-систем, американские коллеги впервые делали доклад о ситуации у них. Представители организаций NIH (National Institutes of Health) и FDA U.S. (Food and Drug Administration) рассказали, что они только начинают разработку своих in vitro тестов, и пока в сфере тестирования препаратов в Америке лидируют так называемые предсказательные химические исследования, в том числе и на клетках. Для этого строят целые заводы, оснащённые и масс-спектрометрами, и ЯМР, и прочим оборудованием (проект Tox21C). Туда, условно, загружают 10 тысяч веществ, которые роботы проверяют на безопасность, скажем по 100 параметрам.
Европа - наш союзник в развитии микробиотехнологий, а США - основной конкурент. Чего удалось достичь американцам на данный момент в разработке направления «человек-на-чипе»-
Д.С.: В сентябре 2011 году Барак Обама объявил о запуске программы при участии таких крупных организаций, как DARPA (Defense Advanced Research Projects Agency), FDA, NIH, по разработке новых технологий для тестирования лекарственных средств, которые будут быстрее и эффективнее существующих методов. Для решения этой задачи в декабре 2011 был создан новый научно-исследовательский институт NIH - National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS). Его задачей стала разработка новых лекарственных средств и технологии их тестирования. В частности, среди приоритетных задач стоит разработка проекта, аналогичного «человеку-на-чипе». Сейчас этим занимаются 2 группы, кроме этого 17 групп делают клеточные модели органов. Суммарный бюджет исследований составляет более 200 миллионов долларов. То есть в перспективе, в течение 3-5 лет, в США случится прорыв в этой области.
Европа старается не отставать. Так, например, сейчас в новой программе Horizon2020 закладывается план развития различных технологий тестирования токсичности и эффективности. БиоКлиникум входит в европейский консорциум AXLR8. Я принимал участие в качестве приглашённого лектора с докладом о наших достижениях. А в следующем году будет проходить крупная конференция, которая проводится раз в два года, куда съедутся все люди, которые занимаются 3D-культурами, «человеком-на-чипе», сокультивированием, микромоделями органов и прочим. Наши успехи в полной мере признаются европейскими коллегами, как минимум - европейскими коллегами.
А в России сейчас выводятся на рынок лекарственные препараты, или большая их часть закупается за рубежом- Перефразируя вопрос, насколько «Гомункулус» необходим в России-
Д.С.: По этому вопросу существует статистика Минздрава. Если я не ошибаюсь, то в 2012 году было выдано около 600 разрешений на проведение клинических исследований. Из них около 350 препаратов - это импортные вещества, которые проходят испытания у нас, чуть больше половины из оставшихся - дженерики, и то, что осталось (около 120 препаратов) - это оригинальные отечественные лекарства.
Да, объёмы действительно небольшие, но 600 разрешений на клинические исследования были получены после доклинических испытаний 6000 препаратов, а это - колоссальные денежные затраты.
Какова поддержка ваших исследований со стороны российского правительства-
Д.С.: Сейчас у нас выполняются 2 гранта Минобрнауки, и в настоящее время как раз происходит разработка и утверждение новых программ. В марте этого года была собрана комиссия по биотехнологии, где биочиповые и биосенсорные технологии были признаны наиболее перспективными направлениями в биотехнологии и биомедицинских исследованиях.
Сейчас мы находимся на переходном этапе, когда стало понятно, что необходимо развивать эти технологии, и теперь БиоКлиникум старается включиться в различные программы, в том числе и государственные, чтобы не потерять конкурентоспособность, которая сейчас у нас есть. Несмотря на развёрнутую американскую программу, мы пока на год-полтора их опережаем, поскольку у нас уже есть платформа, уже есть клеточные наработки, то есть мы уже можем проводить некоторые исследования на нашей системе. В России мы являемся абсолютными пионерами, и именно нам придётся заняться созданием соответствующего рыночного сегмента.
Возможно, я буду излишне оптимистичен, но у нас есть в этой области хороший задел, и мы уже достаточно близки к тому, чтобы сделать колоссальный скачок вперёд в области доклинических технологий, для чего необходимо осуществить переход на in vitro тесты, как это происходит сейчас в Европе. Осталось только убедить в этом вышестоящие инстанции и подработать законодательную базу о доклинических исследованиях, которая, по сути, несущественно изменилась с 80-х годов прошлого века.
Нам бы очень хотелось, чтобы российский рынок откликнулся на мировые тенденции в доклинических исследованиях. Но даже если этого не произойдёт, у нас остаётся европейская площадка, где наши приборы обладают высокой конкурентоспособностью и, мы надеемся, будут оставаться такими и в дальнейшем.
Какие перспективы вы видите для БиоКлиникум в будущем- Есть ли направления, которые вас интересуют, и проблемы, в которые вы бы хотели углубиться-
Д.С.: Пока все мои мысли крутятся вокруг микробиореактора и его возможных сфер использования. Одно из самых перспективных направлений связано с персонализированной медициной. То есть с помощью «Гомункулуса» возможен анализ чувствительности, например, раковых клеток определённого человека к лекарственным препаратам. Эта технология позволит добиться максимальной эффективности лечения данного конкретного пациента. Это чрезвычайно перспективное направление пока находится в зачаточном состоянии и в Европе, и, тем более, в России.
И второе направление - это экология. Никто нам не мешает поместить в микробиореактор вместо человеческих клеток простейшие водоросли и оценивать по ним состояние окружающей среды. Здесь мы можем смотреть на влияние выбросов заводов, продуктов нефтехимического синтеза и других загрязняющих веществ. Можно создавать мобильные лаборатории, которые помогут в течение короткого промежутка времени (от 1-2 дней до 1-2 недель) тестировать микрофлору и микрофауну, например водоёмов.
Ну, и третье направление - это фундаментальные исследования. Здесь очень важно, что «Гомункулус» является мобильной платформой, которая может быть трансформирована под конкретную научно-исследовательскую задачу. Уровень научно-исследовательских работ постоянно растёт, и учёные нуждаются в новом оборудовании. Если говорить о России, то у «Гомункулуса» есть очень хорошая перспектива стать востребованным, поскольку он превосходит по техническим показателям существующие аналоги, и его поставка будет экономически выгодна для отечественных лабораторий.
