Молекулярные биологи из Нидерландского института исследования рака проверили эффективность нового метода выявления жизненно важных генов, основанного на системе CRISPR-Cas9. Оказалось, что с помощью CRISPR можно добиться гораздо лучших результатов с минимальным количеством шума. Исследование опубликовано в журнале Nature Biotechnology.
Для определения, какие гены являются важными для жизни клетки или развития раковых опухолей, ученые стараются регулировать их активность, чтобы выяснить, как это отразится на организме в целом. Для подавления функций генов обычно применяют метод РНК-интерференции, когда ген ингибируется на стадии процессов транскрипции, созревания РНК или трансляции.
РНК-интерференцию проводят с помощью малых РНК, образующих шпильки (shРНК). Их вводят в клетки с помощью векторов — молекул, используемых для переноса генетического материала. shРНК затем превращаются в малые интерферирующие РНК, которые связываются с информационной РНК и способствуют ее разрезанию. Однако у этого подхода есть ряд недостатков, например, не всегда подавляется экспрессия того гена, что нужно, кроме того, ингибирование может происходить с разной эффективностью.
Цель исследователей заключалась в проверке работоспособности нового метода РНК-интерференции, в котором применяется система CRISPR-Cas9, представляющая собой своего рода молекулярно-генетический иммунитет бактерий. CRISPR — повторяющиеся последовательности ДНК, которые разделены уникальными участками или спейсерами. Эти спейсеры транскрибируются с образованием CRISPR-РНК (crРНК), которые нацелены на определенную мишень, — например, последовательность чужеродной ДНК, принадлежащей вирусу. crРНК связывается с мишенью, после чего последняя разрезается белком Cas9.
В разновидности этого метода, которая называется CRISPR-интерференцией (CRISPRi), белок Cas9 является «мертвым», он не разрезает мишень, но подавляет транскрипцию нужного гена.
Биологи сравнили эффективность различных методов подавления экспрессии генов: shРНК, CRISPR и CRISPRi. Для исследования ученые выбрали 93 гена и следили за их активностью в RT-112 — культуре клеток человеческой карциномы. Результаты показали, что метод CRISPR является наилучшим подходом по выявлению важных генов, превосходя shРНК и CRISPRi.
